Znanstvenici sa Southamptona, Velika Britanija, te s Ulma i Karlsruha u Njemačkoj pokazali su da varijanta fluorescentnog proteina (FP), prvobitno izoliranog iz koraljnog grebena, ima odlična svojstva kao protein marker za superrezolucijsku mikroskopiju u živim stanicama. Njihova otkrića objavljena su online te će se pojaviti u tisku u predstojećem kolovozu časopisa Nature Methods.

Fluorescentni proteini proizvedeni od niza morskih životinja sjaje se u duginim bojama, dodajući vizualni spektakl koraljnim grebenima. Tijekom posljednjih godina molekularni su biolozi izolirali brojne FP-e i njihove gene te ih koristili za stvaranje genetskih varijanti FP-a s posebnim karakteristikama emitiranja svjetla.

“Fluorescentni pigmenti iz koralja i srodnih životinja pokazali su se neprocjenjivim vodećim strukturama za izradu naprednih markera za biomedicinska istraživanja”, rekao je dr. Jörg Wiedenmann s University of Southampton`s School of Ocean and Earth Science (SOES), koje je smješteno na National Oceanography Centre, Southampton: “Oni omogućuju mnoštvo uzbudljivih eksperimenata, uključujući i neinvazivna istraživanja dinamičkih procesa unutar živih stanica.”

Fotoaktivni FP-i (PA-FP-i), kao što im ime govori, aktivirat će svjetlo. Kada se svjetlo određene valne duljine usmjeri na njih, oni počmu sjajiti emitirajući svjetlost karakterističnih nijansi. Wiedenmann i njegovi suradnici prethodno su opisali EosFP, PA-FP protein iz koralja Lobophyllia koji gradi grebene. Genetski inženjering dao je različite IrisFP-e s dvojnim fotoaktivnim kapacitetom. U jednom su načinu ireverzibilno “fotokonvertirani” iz zelene u crvenu emitirajuću formu pod ljubičastim svjetlom. U drugom načinu te dvije forme koje emitiraju svjetlo mogu se aktivirati i isključiti više ili manje, po volji, pomoću svjetlosti različitih valnih duljina (`foto-switching`).

Za uporabu u eksperimentima u staničnoj biologiji PA-FP-i genetski se spajaju s proteinima od interesa te se eksprehiraju u živim stanicama. Male regije stanice onda se osvijetle laserskim svjetlom određene valne duljine, uzrokujući da protein marker emitira svjetlo na drugoj valnoj duljini. To omogućuje vizualizaciju dinamičkih procesa stanica i njihovo proučavanje pod mikroskopom.

U izvornom stanju, četiri molekule IrisFP zajedno se spajaju formirajući tetramer koji stvara probleme za primjenu pri spajanju s proteinom. Kako bi to zaobišli, znanstvenici su modificirali protein uvođenjem četiri mutacije. One čine pojedinačnu IrisFP molekulu (monomer) stabilnijom, smanjujući njezinu sklonost da formira tetramere.

“Monomerna varijanta, mIrisFP, zadržava dvojni fotoaktivni kapacitet i ima odlična svojstva kao genetsko kodirani fluorescentni protein marker”, objasnio je Wiedenmann. Za testiranje korisnosti mIrisFP-a, istraživači su ga genetski spojili s brojnim drugim proteinima unutar stanica kulture. Među njima su transkripcijski faktori koji reguliraju ekspresiju gena unutar stanične jezgre te sastavni proteini staničnog skeleta (`citoskelet`). U svim je slučajevima spajanje proteina funkcioniralo normalno.

Daljnji eksperimenti pokazali su da bi se spajanje mIrisFP-a i proteina moglo, kao i očekivano, koristiti za istraživanje dinamičkih procesa u živim stanicama s prostornom rezolucijom izvan granica konvencionalnog svjetlosnog mikroskopa. Naime, istraživači su uspješno spojili tzv. eksperimente o pulsu s fotoaktivnom lokaliziranom mikroskopijom (PALM) kako bi pratili kretanje fluorescencije označenih fuziranih proteina tijekom vremena i pri vrlo visokoj prostornoj rezoluciji. “Dvojna fotoaktivna sposobnost i priroda monomera mIrisFP trebala bi omogućiti biolozima stanice da izvedu širi spektar eksperimenata nego što je to moguće korištenjem samo konvencionalnih PA-FPS”, kaže Wiedenmann.

“Morske životinje kao što su koralji i moruzgve nisu samo lijepi i važni za funkcioniranje ekosustava već su i izvor fluorescentnih proteina koji imaju ogromnu vrijednost u biomedicinskim istraživanjima”, dodao je znanstvenik.

Izvor: National Oceanography Centre